Streptavidin Sigma CAS 9013-20-1

1. Ismerje meg a streptavidint
A Streptavidin (SA), a Streptomyces avidinii-ből származó szekretált fehérje molekulatömege körülbelül 65{2}}66 kDa, izoelektromos pontja pedig körülbelül 6,0. Ez egy tetramer fehérje, amely négy homológ alegységből áll, amelyek mindegyike önálló biotinkötő hellyel rendelkezik – ami azt jelenti, hogy egy sztreptavidin molekula egyidejűleg négy biotinmolekulához tud kötődni. A kettő közötti disszociációs állandó (Kd) már körülbelül 10-15 M, ami az egyik legerősebb ismert nem kovalens biológiai kölcsönhatás, és a természetben a legpontosabb "molekuláris zárómechanizmusnak" tekinthető.

A tojásfehérjéből származó avidinnel összehasonlítva páratlan előnyei vannak:

Nem tartalmaz glikozilációs módosításokat, összességében elektromosan semleges, ezért rendkívül alacsony a nem specifikus kötődése fiziológiás körülmények között, tiszta kísérleti háttérrel és kiváló jel-/-zaj aránnyal rendelkezik. Emellett kiváló denaturációval és proteázlebontással szembeni ellenálló képessége, valamint szélsőséges pH-nak, magas hőmérsékletnek (70-80 °C), szerves oldószereknek és hagyományos denaturálószereknek (például SDS-nek és karbamidnak) ellenálló képessége felváltotta az avidint, és vitathatatlan "arany standard" lett a biotinkötő rendszerekben.

Éppen ezekkel a kiemelkedő tulajdonságokkal tündököl olyan területeken, mint az élettudományok, az in vitro diagnosztika, a gyógyszerszűrés és a bioszenzáció.

2. Immunvizsgálat
Az immundetektálás területén a legklasszikusabb és legszélesebb körben használt alkalmazás. Az 1970-es évek végén történt kifejlesztése óta a biotin-sztreptavidin rendszer (BAS) ultra-nagy affinitása és kaszkáderősítő hatása miatt az immunjelölés és nyomkövetési elemzés sarokkövévé vált. A statisztikák szerint az elterjedt kemilumineszcenciás analizátorok mintegy 85%-a BAS alapú detektálási módszereket használ, jelezve domináns pozíciójukat.

2.1 Enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat (ELISA)

Az ELISA-ban a torma-peroxidáz (HRP) vagy az alkalikus foszfatáz (AP) kapcsolható, és az enzim pontosan a célponthoz vezethető biotinilált antitesteken keresztül. A HRP katalizálja a TMB, DAB vagy ECL lumineszcens szubsztrátokat, hogy erős kémiai vagy optikai jeleket állítson elő, míg az AP katalizálja a BCIP/NBT, PNPP és más szubsztrátokat, hogy stabil szín- vagy kemilumineszcens jeleket állítson elő. A biotinilált célmolekula több jelölt sztreptavidinhez is kötődhet, több-szintű jelerősítést érve el, és lehetővé teszi az alacsony gyakoriságú célpontok kimutatását. Ezt a technológiát széles körben használják szendvics- és kompetitív ELISA-ban, amely olyan forgatókönyveket fed le, mint a fehérje mennyiségi meghatározása, antitestek kimutatása, kórokozók szűrése stb.

2.2 Fehérje immunoblot (Western Blot)
Western blotban a biotinilált másodlagos antitestekhez való kötődés jelentősen növelheti a célfehérjék jelintenzitását a transzfer filmeken. A hagyományos másodlagos antitestrendszerekhez képest a BAS-rendszerek négyértékű kötési tulajdonságaiknak köszönhetően erősebb jelerősítést tudnak elérni. Ezenkívül a sztreptavidin alacsony nem-specifikus kötődése miatt a háttér interferencia jelentősen csökken, így különösen alkalmasak az alacsony abundanciájú fehérjék kvantitatív elemzésére.

2.3 Immunhisztokémia (IHC) és immuncitokémia (ICC)
A HRP-vel vagy AP-vel jelölt sztreptavidin az IHC és ICC jelerősítő eszköze. A HRP rendszer olyan kísérletekhez alkalmas, amelyek rendkívül nagy detektálási érzékenységet igényelnek, míg az AP rendszer különösen alkalmas HRP-inhibitorokat (például nátrium-azidot) tartalmazó rendszerekhez vagy olyan kísérleti forgatókönyvekhez, amelyek hosszú távú színfejlesztést és jelstabilitást igényelnek. A biotinilált próbák vagy antitestek streptavidin konjugátumokhoz való kötésével a célmolekulák pontosan meghatározhatók a szövetmetszetekben vagy sejtmintákban.

2.4 Immunfluoreszcencia (IF) és in situ hibridizáció (ISH)

A fluoreszceinnel jelölt sztreptavidin (például FITC Streptavidin, PE Streptavidin, APC Streptavidin) egy univerzális vizualizációs eszköz immunfluoreszcens festéshez és in situ hibridizációhoz. A FITC marker gerjesztési/emissziós hullámhossza körülbelül 494/519 nm, és élénkzöld fluoreszcenciát mutat; A PE marker gerjesztési/emissziós hullámhossza körülbelül 565/578 nm, ami az "arany standard" a többszínű áramlási citometriás elemzéshez; Az APC marker lefedi a távoli vörös spektrumot, megkönnyítve a többszínű képalkotást. Ezek a fluoreszcens markerek pontosan tudnak kötődni biotinilált antitestekhez vagy nukleinsavpróbákhoz, hogy elérjék a lokalizációs elemzést és a célmolekulák mennyiségi kimutatását.

2.5 Áramlási citometria (FACS)

Az áramlási citometriában fluoreszcensen jelölt sztreptavidint (különösen PE-vel jelölt) használnak a biotinilált antitestekkel jelölt sejtfelszíni antigének kimutatására. Kiváló fényereje rendkívül magas jel-/-zaj arányt biztosít, amely hatékonyan képes kimutatni az alacsony felszíni antigénexpressziójú vagy gyenge jelű sejtpopulációkat. Nélkülözhetetlen reagens a több-színes áramlási citometriás elemzésben.

2.6 Enzimhez kötött immunszpot vizsgálat (ELISPOT)
Az AP-vel jelölt sztreptavidin kiváló teljesítményt mutat az ELISPOT-ban, és alkalmas szilárd{0}}fázisú analízisre és szövet-/sejtfestési rendszerekre. Stabilan katalizálhatja a megszámlálható spot jelek szubsztráttermelését az egy-sejtszintű citokinszekréció kimutatásához.

3. Fehérjék és nukleinsavak tisztítása
3.1. Affinitáskromatográfia és fehérjetisztítás
A sztreptomicin az affinitáskromatográfiás csomagolás központi összetevője. A tisztítandó fehérje biotinnal történő jelölése után sztreptavidin agaróz géllel (például Streptavidin Agarose/Sepharose) összekeverjük, és a jelölt fehérje szorosan kötődik a töltőanyagon lévő streptavidinhez. Mosással a szennyeződések eltávolítására, majd a célfehérjét megfelelő körülmények között (például forrásban lévő SDS-PAGE puffer, 0,1% SDS kezelés vagy 95% formamid+10 mM EDTA kezelés 8,2 pH-n) mosással nagy-tisztaságú termékeket kaphatunk.

Példaként a rekombináns humán inzulin ipari előállítását tekintve a kiváló minőségű sztreptavidin mágneses gyöngyök több mint 1200 pmol szabad biotint képesek megkötni milligrammonként, és a tisztított fehérje tisztasága elérheti a 95%-ot.

3.2 Immunprecipitáció (IP) és kromatin immunprecipitáció (ChIP)
A streptavidin mágneses gyöngyök alkalmazása immunprecipitációban nagymértékben javítja a kísérleti hatékonyságot. A kutatók biotinilált antitesteket rögzíthetnek sztreptavidin mágneses gyöngyökön, és sejtlizátummal együtt inkubálhatják azokat.

Az antitestek specifikusan megragadják a célfehérjét és a kölcsönhatásba lépő fehérjéket, és egy "mágneses gyöngy antitest célfehérje" komplexet alkotnak. Külső mágneses tér hatására gyorsan szétválasztható, egyszerű kezeléssel és nagy érzékenységgel. A ChIP-kísérletekben streptavidin mágneses gyöngyöket is használtak biotinilált DNS-fehérje komplexek rögzítésére, valamint a fehérjék és a DNS közötti kölcsönhatás tanulmányozására.

3.3 Lehúzási kísérlet
A fehérje{0}}fehérje kölcsönhatások tanulmányozása során a mágneses gyöngyök képesek felfogni a biotinilált csalifehérjéket, majd „meghalászni” a velük kölcsönhatásba lépő előfehérjéket. Például a tumorsejtekben a kulcsfontosságú jelátviteli útvonalak tanulmányozásakor a P53 fehérjét felismerő specifikus antitesteket sztreptavidin mágneses gyöngyökön rögzítik, és tumorsejt-lizátummal együtt inkubálják, hogy hatékonyan dúsítsák a P53-at és a kapcsolódó fehérjéket. A hagyományos immunprecipitációs módszerekkel összehasonlítva a mágneses gyöngy IP nagyobb érzékenységgel és specificitással rendelkezik, és hatékonyabban képes gazdagítani az alacsony abundanciájú célfehérjéket.

3.4 RNA Pull-down
A mágneses gyöngyök RNS lehúzó{0}}kísérletekhez is alkalmasak. A sztreptavidin mágneses gyöngyökhöz való kötődés után a biotinilált RNS-próbák képesek befogni a sejtlizátumokból származó RNS-sel kölcsönhatásba lépő fehérjéket az RNS-fehérje kölcsönhatási hálózatok tanulmányozása érdekében.
3.5 Egyszálú DNS előkészítése és nukleinsav extrakció
Biotinilezett oligonukleotidokhoz kötődhet egyszálú DNS előállításához és nukleinsavak hatékony extrakciójához, fontos szerepet játszik a molekuláris klónozásban és a géntechnológiában.

4. Nagy áteresztőképességű kimutatás és gyógyszerszűrés
4.1. TR-FRET tesztelési platform
Összekapcsolható lumineszcens kelátokkal, például európium-kelátokkal, hogy a TR-FRET (időfelbontású-fluoreszcens rezonancia energiatranszfer) detektáló rendszerben jelösszeköttetést és molekuláris rögzítést hajtson végre. Például a THUNDER™ Az európiummal jelölt sztreptavidin, amelyet kifejezetten a TR-FRET kísérleti platformhoz terveztek, stabilan kötődhet különféle biotinilezett módosított molekulákhoz, és széles körben használják fehérjekölcsönhatás-elemzésben és a célgyógyszerek előzetes szűrésében.

Ez a rendszer homogén és nagy{0}}áteresztőképességű, így hatékony eszköze a modern gyógyszerfejlesztésnek.

4.2 Célzott gyógyszerszállítás
Biotinkötő tulajdonságai ideális hordozóvá teszik a gyógyszer célzott bejuttatási rendszerek számára. A gyógyszermolekulák biotinnal való összekapcsolásával és a sztreptavidin célzott kötőképességének kihasználásával precíz gyógyszerbejuttatás érhető el, javítva a kezelés hatékonyságát és csökkentve a mellékhatásokat.

4.3 Bioszenzorok és biochipek

Ez a bioszenzorok és biochipek gyártásának alapanyaga. A sztreptavidint a chip felületére rögzítő elemként rögzítve biotinnal jelölt fehérjepróbák vagy antitestek rögzíthetők rajta, ami nagy-áteresztőképességű és nagy-érzékenységű detektálást érhet el. Például a fehérje chipek szív- és érrendszeri betegségek korai szűrésekor a sztreptavidin mágneses gyöngyöket rögzítik a chip szubsztrátjára, és biotinilált fehérjepróbák megkötésére használják. Ezzel pontosan kimutathatóak a rendellenességek a betegeknél a betegség korai stádiumában, és amikor a vérmarkerek koncentrációja már 0,01 ng/ml cTnI-érték alatt van, ami 2-3 órával előrehalad a diagnosztikai ablakban a hagyományos diagnosztikai módszerekhez képest.

5. Sejtbiológia és képalkotás
5.1 Sejtfelszíni jelölés és fluoreszcens sejtválogatás
A fluoreszcensen jelölt sztreptavidint (mint például a Vari Fluor 488 Streptavidint) széles körben használják sejtfelszíni jelölésre és fluoreszcens sejtválogatásra. Emissziós spektruma lefedi a látható és közeli infravörös fény teljes spektrumát, több-színes jelölési kísérletekben pedig könnyen behatol a sejtmagba és a citoplazma szerkezetébe, megjelöli a célfehérjéket képalkotás és elemzés céljából.

5.2 Nanotechnológia és anyag önszerelés
Négyértékű kötési tulajdonságai miatt ideális „híd” a nanoanyagok ön{0}}összerakásához. A biotin sztreptavidin célzott kötésével különféle nanostruktúrák hozhatók létre olyan interdiszciplináris kutatásokhoz, mint a biológiai képalkotás és a környezeti monitorozás.

6. Streptavidin elleni antitest
A sztreptavidin biotin rendszer széles körben elterjedt használatával egy gyakran figyelmen kívül hagyott probléma merült fel - a mintában lévő endogén antisztreptavidin antitestek (ASA) zavarhatják a kimutatási rendszert. A kutatások azt találták, hogy az ASA-nak az SA-hoz való kötődése a reakciórendszerben befolyásolhatja a specifikus antigén-antitest-rendszerek megfelelő felépítését, ami a kapcsolási, kimutatási vagy diagnosztikai eredmények pontosságát veszélyezteti.

Ennek a kihívásnak a megoldására antisztreptavidin antitest-detektáló készletek jelentek meg, amelyek segítségével kimutatható az endogén ASA a betegmintákban, és elkerülhető a BAS rendszerrel való interferencia. A Roche Custom Biotech kifejlesztett egy inaktív sztreptavidin mutánst (Streptavidin rec. inactive, poly), amely további lépések nélkül hozzáadható a jelenlegi rendszerhez az ASA interferencia specifikus blokkolása és kiküszöbölése érdekében, javítva az észlelési rendszer pontosságát és specifitását.

7. Biotin interferencia
Bár a sztreptavidin biotin rendszer erős, egyre súlyosabb kihívással kell szembenéznie, - a biotin interferencia.

Ha a vizsgált mintában nagy koncentrációban van szabad biotin, az a biotinilált antitestekkel verseng a sztreptavidin kötőhelyéért, ami torz kimutatási eredményeket eredményez.

100 mg biotin orális adagolása 375-450 ng/ml plazma csúcskoncentrációhoz vezethet; A sclerosis multiplexben szenvedő betegek napi 300 mg-ot kaphatnak szájon át, a plazma biotinszintje pedig meghaladhatja az 1000 ng/ml-t; Napi 500 mg biotin bevitele rendkívül magas biotinkoncentrációhoz vezethet a vérben. A szendvics immunoassay során a túlzott biotin tévesen alacsony eredményeket eredményezhet; A kompetitív immunológiai vizsgálatok során tévesen magas eredményekhez vezethet.

Számos tanulmány kimutatta, hogy a TSH, a tiroxin PTH, az endokrin tesztek, mint például az adrenokortikotrop hormon, a prolaktin, a tesztoszteron, a kortizol, valamint a tumormarkerek és a szívfunkciós markerek különböző mértékben befolyásolják a biotin interferenciáját. Az FDA egymás után figyelmeztető információkat és megfelelő iránymutatásokat adott ki. A megküzdési stratégiák a következők: a minták sorozatos hígítása, átállás nem BAS-módszerekre, például folyadékkromatográfiára -tömegspektrometria, biotintisztítás utáni újratesztelés (legfeljebb 2 óra, akár 15 nap vagy akár hónap is), vagy ingyenes biotinfogók használata.