Aprotinin CAS 9087-70-1

Aprotinin78R2S7, molekulaképlet C284H432N84O, CAS 9087-70-1, Proteáz inhibitor, amely gátolja a tripszin és a kimotripszin működését, megakadályozza más aktív proteaszómák aktiválódását a hasnyálmirigyben és a tripszinogén önaktiválását. Klinikailag alkalmazzák akut hasnyálmirigy-gyulladás, fibrinolízis okozta vérzés és disszeminált intravaszkuláris koaguláció megelőzésére és kezelésére. Sokk elleni kezelésre is használható. A proteáz-inhibitorok olyan anyagok, amelyek enzimekhez kötődnek, és csökkentik a szubsztrát lebomlásának sebességét. A fehérjetulajdonságokkal rendelkező proteáz-inhibitorok széles körben jelen vannak, és kétféle, fehérjetulajdonságokkal rendelkező proteáz-inhibitort izoláltak a szójából: Kuniz tripszin-gátlót és Baumann Bellck-inhibitort. Az előbbi molekulatömege 20-25 ku, míg az utóbbi molekulatömege 8 ku.

Rekombinánsaprotinin(RTI16) gátolhatja a kininázt és a tripszint, és egy természetes nem-specifikus szerinproteáz inhibitor. Ez egy egyláncú bázikus fehérje, amely 58 aminosavból áll, és a láncban 3 diszulfidkötés kapcsolódik. Az aprotinnt régóta használják akut hasnyálmirigy-gyulladás kezelésére. Az 1990-es évek után a rekombináns aprotinnt a szív-mellkasi sebészetben kezdték alkalmazni a vérlemezkék védelmére, a vérzés és a váladékozás csökkentésére, valamint a véralvadási zavarokban szenvedő betegek klinikai kezelésére. Ezért az aprotinn piaci mérete gyorsan bővült, és az egyik fontos biokémiai gyógyszerré vált.

Szintézis

 

Jelenleg a kereskedelemben kapható rekombináns aprotinn-készítmények főként olyan szervekből, mint például szarvasmarha-tüdőkből származó kivonatok, amelyek bonyolult folyamatokkal és magas költségekkel járnak. Ezért nagy jelentősége van a rekombináns aprotinn előállításának géntechnológiai módszerekkel történő feltárásának.

Szekréciós expressziós rendszer alkalmazásakor az aprotinn termelése általában alacsony, és a keletkező termék aktivitása is alacsony. A fúziós expresszió révén várhatóan nagymértékben növeli a rekombináns aprotinn expressziós szintjét.

 

Erre a célra egy rekombináns aprotinn expressziós plazmidot, a pGrxA BPTI-t állítottunk elő, és egy FXa felismerési helyet terveztünk a fúziós partner és a rekombináns aprotinn között. Miután zárványtest formájában expresszáltuk, a fúziós partnert megtisztítottuk és gélszűréssel újra hajtogattuk. A fúziós partnert FXa-val kivágtuk, hogy a természetes termékével azonos aktivitású fehérjét kapjunk. Az expressziós feltételek optimalizálása révén a hozam jelentősen javult a korábbi expressziós rendszerekhez képest.

Műszaki baktériumok expressziójának optimalizálása:

 

Oltsuk be a glicerincső baktériumokat LB/AMP agarlemezekre, tenyésztjük 37 fokon 20 órán át, kaparjuk le a telepeket, és oltsuk be 5 ml LB/AMP folyékony táptalajba 37 fokos, 200 fordulat/perc hőmérsékleten, majd tenyésztjük egy éjszakán át. Oltsuk be az oltóanyag 5%-át 100 ml kukorica iszapos táptalajba, tenyésztjük 37 fokon és 220 fordulat/perc sebességgel rázógépen, indukáljuk 7 órán át, majd centrifugáljuk (8000 fordulat/perc, 5 perc, 4 fok), hogy összegyűjtsük a baktériumsejteket. Mérjük le a baktériumsejtek nedves tömegét, és 15%-os SDS-PAGE-val detektáljuk expressziójukat.

Erjesztő tartályos termesztés

 

Fermentációs tartályos termesztés:

Német Biostat 30 literes fermentációs tartályt használva, 37 fokon, 20%-ra szabályozott oldott oxigénnel, pH 7,0. Fermentációs tartályt használva a fúziós fehérje expresszálására, 260 g nedves baktériumsejtet nyertünk 16 liter fermentléből, körülbelül 16 g/l; Az expressziós szint körülbelül 45%,

Faltörés és bakteriális sejtek zárványtest felvétele:

 

A tenyésztés befejezése után gyűjtsük össze a baktériumsejteket, adjunk 1 g baktériumsejtet 10 ml A-oldathoz (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA), szuszpendáljuk alaposan, ultrahanggal kezeljük a sejteket jégfürdőben, dolgozzuk 30 másodpercig, intervallum 10 W, teljesítmény 30 W. Tegye át a folyadékot egy centrifugacsőbe, centrifugálja 4 fokkal és 8000 fordulat/perc sebességgel 15 percig, és a csapadék a nyers zárványtest.

Zárványtest oldó oldat elkészítése:

 

Mossa át a nyers zárványtestet B oldattal (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA, 1% Triton-X100) kétszer, minden alkalommal 0,5 órán keresztül, centrifugálja a felülúszó eltávolításához, és viszonylag tiszta zárványtesteket kap. Adjunk hozzá 1 g zárványtestet 5 ml C oldathoz (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 8 mol/L karbamid, 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L DTT), inkubálja egy éjszakán át 4 fokon, denaturálja és oldja, centrifugálja 12 000 fordulat/perc sebességgel, és gyűjtse össze az oldattestet 15 percen keresztül. Szerezzen be rekombináns aprotint.

Farmakológiai hatások:

 

 

Aprotiningátolja a humán tripszint, a fibrinolitikus enzimet, a plazmát és a szöveti angiotenzint bizonyos kémiai arányban képződött reverzibilis enzimgátló komplexeken keresztül. A szerinaktivitással rendelkező proteázok nagy szerepet játszanak a vazopresszin kininogén kinin rendszerében, a komplementrendszerben és a koagulációs rendszerben, ahol a plazmin és a plazma vazopresszin kritikus szerepet játszanak.

 

Az aprotinn gátló hatását úgy fejti ki, hogy aprotinn proteáz komplexet képez az enzim szerin aktív részén keresztül. Különböző proteázokkal kombinálva azonban eltérő disszociációs állandókat mutat. A tripszinhez való kötődés a legerősebb (Ki=0.06nmoN), amely az egyik legalacsonyabb állandó a fehérje-fehérje kölcsönhatásokban (Laydunski és mtsai. 1974). A humán fibrinolitikus enzimhez való kötődés nem túl erős. Az enzimgátló komplex (Ki=1 nmoN) magas K-értéke miatt reverzibilis lehet (Wimann, 1980), a humán plazma angiotenzinhez kötődő komplex pedig meglehetősen gyenge (Ki=30 nmol/l), de még mindig az aprotinn terápiás tartományán belül van (Nakahara, 1983).

 

Az aprotinn nem csak a szabad enzimmolekulákhoz kötődik, hanem olyan enzimekhez is, amelyek már kötődtek egy harmadik komponenshez (ha az enzim aktív központja még rendelkezik kötőképességgel). Ezért az aprotinn gátolja a szabad fibrinolitikus enzimeket, és gátolni tudja a lánckinázzal végzett trombolitikus terápia során kialakuló köztes fibrinolizin lánckináz komplexet is (Wimann, 1980).
Az aprotinn antifibrinolitikus hatása a fehérjehidrolízis által aktivált plazmin gátlásán alapul. A szintetikus antifibrinolitikus oldószerekkel ellentétben a túlaktivált plazmin közvetlen gátlása miatt az aprotinn nemcsak a közvetlen szubsztrátot (fibrint) védi a plazmin általi lebomlástól, hanem a fibrinogént, a plazmában lévő V és VIII faktort, valamint a szérum alfa 2-globulint is.

 

Az endotoxin által kiváltott sokk és hipovolémiás sokk kísérleteiben a Trasylol jelentősen gátolja a kininogén aktiválódását. (Massion et a1, 1972).
A trazilol megelőzheti vagy késleltetheti a tüdő intersticiális ödéma (sokkos tüdő) kialakulását. Gátló hatása dózis-és idő{2}}függő (Lorthioir et al., 1973).
Sokk során az ischaemiás hasnyálmirigy nagyon mérgező peptid anyagot, nevezetesen a szívizom gátló faktort (MDF) képes termelni. Ez a tényező szorosan összefügg a sokkból eredő halállal.

 

Az MDF kimutatható vérzéses, szeptikus, kardiogén sokkban és égési sokkban szenvedő egerek, kutyák, majmok és emberek plazmájában. Az MDF minden vérzéses esetben csökkentheti a szívizom kontraktilitását, ugyanakkor a zsigeri rezisztencia erek összehúzódását okozza, ami lokális ischaemiához és több MDF termeléshez vezet. Ráadásul a retikuloendoteliális rendszerben okozott toxikus károsodás miatt a véráramban való kiürülése késik. A trazilol nagymértékben megakadályozhatja az MDF előállítását (Lefer 1984).

Aprotinin, mint kis molekulájú vegyület, amely ellenáll a fibrinolízisnek, jelentős és specifikus enzimgátló tulajdonságokat mutat. Nemcsak a tripszin aktivitását gátolja hatékonyan, hanem kiterjedten hat más rokon proteolitikus enzimekre is, így fontos szerepet játszik a sejtbiológiai kísérletekben. Különösen a sejt- és szöveti lízis és homogenizálás során az Aprotinn hatékony proteáz inhibitorként szolgálhat, hatékonyan megakadályozva a célfehérjék véletlen lebomlását, ami kulcsfontosságú a minta integritásának és pontosságának megőrzéséhez.

Az Aprotinn gátló hatása egyértelmű dózisfüggést mutat, azaz koncentrációjának növekedésével a fibrinolitikus aktivitást gátló hatása is ennek megfelelően növekszik. Ez a funkció lehetővé teszi a kutatóknak, hogy pontosabban szabályozzák a kísérleti körülményeket, hogy megbízhatóbb és reprodukálhatóbb kísérleti eredményeket kapjanak. Mindeközben az Aprotinn meghosszabbíthatja a vér alvadási idejét, tovább erősítve a véralvadási mechanizmusban betöltött fontos szerepét. In vitro kísérletek kimutatták, hogy az Aprotinn egy hatékony endogén véralvadási útvonal gátló, amely zavarhatja és szabályozhatja a koagulációs folyamat kulcsfontosságú folyamatait.

Az Aprotini egyedülálló farmakológiai hatásait is bizonyította. Jelentősen gátolja a vérrög feloldódási folyamatát in vitro, meghosszabbítja a farokvágási vérzési időt patkányokban, és meghosszabbítja a véralvadási időt az emberi plazmában. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az Aprotinn potenciális vérzéscsillapító és trombózisellenes hatással bír. In vivo hatásának további validálása érdekében a kutatók kísérleteket végeztek patkány arteriovénás rövidzárlati modellen. Az eredmények azt mutatták, hogy az Aprotnin jelentősen csökkentheti a vérrögök tömegét, tovább erősítve antitrombotikus gyógyszerként való potenciálját.

Összefoglalva, az Aprotnin, mint kis molekulájú vegyület, amely gátolja a fibrinolízist, jelentős enzimgátló tulajdonságokat és farmakológiai hatásokat mutatott mind in vitro, mind in vivo. Alkalmazása a sejtbiológiai kísérletekben hatékony eszközöket biztosít a kutatóknak, míg in vivo vizsgálatok eredményei fontos támpontokat és alapot adnak vérzés- és trombózisellenes gyógyszerként való kifejlesztéséhez. A jövőben az Aprotnin hatásmechanizmusának további kutatásával és klinikai vizsgálataival várhatóan szélesebb körű alkalmazását láthatjuk az orvosi területen.

Népszerű tags: aprotinin cas 9087-70-1, beszállítók, gyártók, gyár, nagykereskedelem, vétel, ár, ömlesztve, eladó